食品工場で洗浄殺菌後に清浄度を確認する方法としてATP試験は効果的な手法である。この記事では、ATP試験の基本概念について、わかりやすく解説する。
はじめに
洗浄殺菌した後、その洗浄殺菌の効率を測定し、清浄度管理が適正に行われていることを確認することが重要である。食品微生物学の観点からは、微生物試験が製品への二次汚染を防ぐために最も直接的な方法と考えられる。 しかしながら、微生物試験は、煩雑な手順や時間を要するというデメリットがあり、日常的に簡便で迅速に行うには必ずしも適していない。これに対して、ATP試験は、これらのデメリットを克服し、簡便かつ迅速に清浄度を測定することが可能である。環境や設備の表面から採取した試料中のATP量を測定することで、迅速、簡便に清浄度を評価することができる。
以下に、微生物試験との違いを踏まえつつ、ATP試験の基本的な概念から、実際に食品工場での清浄度管理にどのように活用できるか、わかりやすく解説する。
ATPの生体内での意味
まず、基本的なことから述べる。
光合成を通じて太陽エネルギーが有機物に固定される過程を再確認してみよう。光合成では、植物は光エネルギーを利用し、二酸化炭素と水を組み合わせて、糖類（有機物）を合成する。この糖類は化学エネルギーが蓄積されたものであり、化学エネルギーは積み木を合成する接着剤に例えることが出来る。
植物が燃焼する場合、糖やその他の有機物は空気中の酸素と反応して燃焼し、化学エネルギーが熱や光といった物理エネルギーに変換される。
一方、従属栄養生物である動物や微生物が植物を摂取する場合、有機物（糖など）が分解される過程で、エネルギーの通貨であるATPが生成される。そして、生成されたATPは、筋肉の収縮や生体物質の合成など、生物の様々な生命活動に利用される化学エネルギーとして機能する。
要するに、植物が燃焼すると、その化学エネルギーが物理エネルギーとして放出される。一方、動物が植物を摂取すると、その化学エネルギーが細胞内でATPという化学エネルギー通貨に変換され、生命活動に利用されるようになるわけだ。
ATPの化学構造
ここでATPの化学構造についても簡単に触れておく。
ATPは、アデノシンと3つのリン酸分子から構成される。アデノシンは、アデニンとリボースから成る核酸塩基である。3つのリン酸分子は、アデノシンのリボース部分に結合している。ATP分子の構造は、以下のように表される。
ATPがなぜエネルギー運搬物質として優れているのか？
数ある生体内の化合物の中で、何故ATPがエネルギー運搬物質として優れているのだろうか？
ATPがエネルギー運搬物質として優れている理由は、ATP分子を構成するリン酸結合が高エネルギーであるためである。3つのリン酸分子が互いに反発しながら結合しているため、リン酸結合は高エネルギーの状態にある。
- リン酸分子は負の電荷を帯びており、近接するリン酸分子同士が反発し合うため、その結合には大きな力が必要である。
このような反発し合うリン酸機を結合させるためには強力な力が必要であり、それゆえ、リン酸結合では高エネルギーの状態が生じる。そして、ATPのリン酸結合が切断されることで、この高エネルギー状態は解放され、大量のエネルギーが放出される。
すなわち、ATPがエネルギー運搬物質として優れている理由は、ATP分子が低分子でありながら、分子量に比較すると大量のエネルギーを蓄えることができるためである。このため、ATPは生体内で広く利用され、細胞内のエネルギー供給源として重要な役割を果たしている。
ATP測定法
ATP測定法は、ホタルの発光現象に関与するルシフェラーゼという酵素を基に行われる。では、なぜホタルのルシフェラーゼが使われるのか？まず、ルシフェラーゼとは一体何か、以下で説明する。
ホタルや海中生物の発光
ホタルがルシフェラーゼを用いて光る理由は主に、生態学的に有利なコミュニケーション手段として発光を利用しているからと考えられている。ホタルは種によって特有の発光パターンを持っており、これによって異なる種のホタル同士が区別される。発光により、オスとメスはお互いを認識し、交尾相手を探し出すことができる。
また、ルシフェラーゼを使って光る生物は、海中でもさまざまな種類が存在する。これらの海中でルシフェラーゼで光る生物は、主に深海や暗闇の環境で生息しており、発光を通じて獲物の捕獲や捕食者からの防御、コミュニケーションなど、生存に必要な機能を果たしている。
海中でルシフェラーゼにより光る生物における発光の意味は様々な役割が想定されるが、その一例として、発光プランクトンは、捕食者に食べられた際に消化管内で光り、捕食者を大きな捕食者に目立たせる防御戦略を持つ。これにより、魚はプランクトンを吐き出し、結果として、プランクトンは捕食リスクから逃れることが出来ると考えられている。
ルシフェラーゼによる発光反応
ホタルの発光は、ルシフェラーゼという酵素によって触媒される化学反応の過程でおこなわれる。この反応は、次のステップで進む。
- まずルシフェリンのカルボキシル基がATPと反応し、ルシフェリルAMP中間体ができる。
- 酸素が中間体と反応した後、励起状態のオキシルシフェリンが生成する。
- 励起状態のオキシルシフェリンは、光子を放出して基底状態に戻ることで光が放出さる。
ATP量測定へのホタルルシフェラーゼの応用
ルシフェラーゼ発光反応で生じる発光量は、ATP量に比例する。
したがって、生物試料中におけるATP含量を測定するために、ルシフェラーゼによる発光量を利用することができる。
ホタルルシフェラーゼを応用してATP濃度測定を初めて試みたのは、1966年にBrewer and Knutsenによる血中のATP濃度測定の研究であると考えられる。
Brewer, G.J., Knutsen, C.A.
A technique for the processing of blood samples for subsequent assay of ATP, and an investigation of the method of standardization of the firefly-luciferase ATP assay
Clinica Chimica Acta 14(6), pp. 836-839（ 1966 ）
Brewer and Knutsenの論文発表後、生化学研究の様々な分野で本方法は用いられてきた。
遺伝子組み換え大腸菌によるルシフェラーゼの大量生産化
上記のように、ホタルルシフェラーゼを応用してATP濃度測定原理や測定法は、1960年代から明らかになっていたが、ルシフェラーゼをホタルからの抽出精製するのは、高いコスト、安定性などの点で、幅広い普及には至らなかった。
ホタルルシフェラーゼを応用してATP濃度測定へ活路を開かれたのは1980年代後半に入ってからである。当時は、遺伝子のクローニング技術は組み換え発現などの分子生物学的手法の黎明期であった。1988年、これらの新技術を用いて、日本のキッコーマン社の本間 茂博士らが、ホタルルシフェラーゼの遺伝子を大腸菌に組み込み大量発現に成功した。
本間博士らの開発が、その後の、ATPの食品産業への幅広い応用への端緒となった。これらの開発の経緯の詳細は、下記をご参照いただくとよいだろう。
本間 茂
ATP測定応用技術の将来ー新しい衛生検査手法の確立を目指して（[化学装置]2001年2月号(工業調査会)）
食品工場の清浄度管理のためのATP試験法
ATP測定法は、ルシフェラーゼの大量生産が可能になったことで、食品産業界をはじめとする多くの分野で活用されるようになった。
なぜ食品工場でATP測定法が重要なのか？
その理由は、ATP測定法が迅速かつ簡単に清浄度をチェックできるからである。従来、洗浄後の微生物数を測定するためには、時間と手間がかかる方法が主流であったが、ATP測定法の登場により、食品工場の洗浄効果をすぐに確認できるようになった。
なお、 当初、ATP測定法は従来の微生物測定の代替法としてその役割が期待された。ただし、ATPは食品由来の有機物中にも含まれるため、微生物数の指標としては完璧ではない。
そこで、現在では、ATP測定法は食品工場の洗浄作業後に残る有機物の量を判定する方法として活用されている。これにより、食品工場では、洗浄後の製造ラインに残る有機物の量を確認し、適切な清掃が行われているかどうかを簡単にチェックできるようになった。
測定手順
以下では、一般的なATP試験の手順について概略を説明しておく。ただし、本ブログは実験マニュアルを提供することが目的ではなく、あくまで実験の概要を理解していただくことが目的であるので、その点に重点を置いて記述する。
❶試料採取
まず、食品工場内の環境や設備の表面から試料を採取する。試料採取には、ATP測定機器一式に付属の綿棒が市販されている。試料採取時には、通常、第１段階においては工場のエリア全体を行い、第二段階で、汚染の可能性が高いエリアや生産ライン上の重要なポイントを選択することが望ましい。
❷試料抽出
採取した試料を適切な抽出液に浸し、試料中のATPを溶出させる。上記で試料採取した綿棒をそのまま抽出液に差し込むだけでこの過程が終了するキットが市販されている。
❸ATP測定
抽出液中のATP量を測定するために、ルシフェリンとルシフェラーゼという化学発光試薬を使用する。抽出液と試薬を混合し、ATPとの反応によって発生する発光を検出する。発光の強度は、試料中のATP量に比例する。なお、❸の化学発光試薬との混合は、❷の試料抽出と同時操作でできるキットが市販されている。
❹測定機器
ATPの測定には、専用の機器であるルミノメータが使用される。ルミノメータは、試薬と抽出液の混合物中で発生する発光を検出し、発光の強度からATP量を算出する。一部のルミノメータは、測定結果をデータとして記録・分析する機能も備えている。
❺結果の解釈
ルミノメータで得られた測定結果を、事前に設定された基準値と比較して、清浄度を評価する。基準値は、各食品工場の状況に応じて設定されるべきである。
まとめ
ATP試験を適切に実施し、その制約事項を理解した上で、他の試験方法と組み合わせることで、より包括的な食品工場の清潔度管理が可能となる。例えば、ATP試験によって有機物汚れの残りやすい箇所を特定し、重点的な洗浄・殺菌を行い、最終的には微生物試験を組み合わせるなど、必要に応じて他の試験方法を併用することで、より効果的な活用が可能となるであろう。
なお、食品製造工場におけるATP測定の活用の実際の例については、本ブログで今後、個別に事例紹介をしていく予定である。
