グラム陰性菌の整理に必要なOF試験判定

  分離した細菌がグラム陰性桿菌である場合、次に重要な判断は、好気性細菌か通性嫌気性菌の判定である。本記事では、細菌の増殖と酸素の関係を理解するために、まずは、解糖系とは何か、クエン酸回路(TCA回路)とは何か、電子伝達系とは何かについて、遊園地で子供たちがジェットコースターに乗る場合に例えて、ATP(エネルギー)の産生量の違いを重点にわかりやすく説明を加える。また、好気性細菌とは何か、通性嫌気性菌とは何か、偏性嫌気性菌とは何か、OF試験の原理や判定方法についても述べる。

食品分野ではグラム陰性菌で最初に知るべきは、好気性細菌と通性嫌気性菌

 分離した細菌はグラム陰性菌であった場合に、最初に知るべき事項はその細菌は好気性細菌か通性嫌気性菌かである。

・好気性細菌とは、その増殖に酸素を必要とする細菌のことである。酸素があればクエン酸回路(TCA回路、もしくは発見者の名前にちなんで、クレブス回路)により活発に、大量のエネルギー(38ATP)を得て、大量に増殖する。
 

・通性嫌気性菌とは、酸素があってもなくてもどちらの条件でも増殖できる細菌である。 酸素があればクエン酸回路により活発にエネルギーを得て大量に増殖するが、酸素がなくなれば、解糖系のみでATPを得る。酸素がない場合は、有機物は二酸化炭素と水にまでは分解されない。その代わり、有機酸が中間産物として残る。また、得られるエネルギーは酸素がある場合に比べてとても少ない(2ATP)。しかし、通性嫌気菌はこの少ないエネルギー代謝でも増殖をすることは可能である。
 

グラム陰性菌の分類図式
微生物の増殖と酸素による仕分け

食品微生物学では、グラム陰性菌の偏性嫌気菌は存在しない

 ところで微生物の教科書的には、細菌を好気性細菌と、通性嫌気性菌に加えて、偏性偏性嫌気菌がある。

・ 偏性嫌気菌とは 酸素がないところでは活発に増殖するが、酸素があるとそれが有害に働き、緩やかに死滅してしまう細菌のことである。後でこれらの細菌についても、代謝機能の観点から説明する。

 しかしここで理解していただきたいのは、食品微生物分野において、グラム陰性菌を考えた場合、偏性嫌気菌はほとんど登場しないことである。食品微生物分野で偏性嫌気性菌が重要になってくるのは、グラム陽性菌のみである。 グラム陽性 については次回以降の記事で述べていきたい。

 なぜ食品微生物学分野では、グラム陰性菌の偏性嫌気菌が存在しないのか?次のように考えればわかりやすいだろう。そもそもグラム陰性菌はこれまでの記事で述べてきたように環境ストレスに弱い。加えてこれらが偏性嫌気菌であった場合、 真空包装でしか増殖できないというだけにとどまらず、そもそも酸素が 有害に働く。したがって、食品のような空気環境にさらされる環境においては、そもそも生き残れない。芽胞を形成する場合は別である。しかし、耐熱性芽胞を形成するのはすべてグラム陽性菌である。以上の理由から、 食品微生物学分野では、グラム陰性菌の偏性嫌気菌が存在しな い。

 なお、以上の他に、微好気性菌というグループも存在するが、これについての詳細はカンピロバクターの記事をご覧いただきたい。

※微好気性細菌についてはこちら
食中毒菌10種類の覚え方 ③カンピロバクター

光合成とは?従属栄養細菌にとって呼吸とは?

 ここで、そもそも呼吸とは何かについての基礎事項を述べる。微生物や人間は皆従属栄養微生物である。一方、植物は、光合成生物である。光合成生物は、太陽エネルギーを固定できる能力を持っている。二酸化炭素や水などを組み合わせて有機物を作る。これは小さなブロックを組み合わせて大きなブロックをつくることに例えることができる。この際に一つ一つのブロックを接着する接着剤が必要となる。これが太陽エネルギーである。つまり太陽エネルギーが有機物を合成するための接着剤としての化学エネルギーに変換されるわけだ。

光合成と従属栄養

  一方、私たち動物やバクテリアはいくら太陽に向けて口を開けていても太陽エネルギーを固定できない。そこで私達、従属栄養生物は植物を破壊する。植物の破壊によってそこから取り出される化学エネルギーを利用する。私たち人間も細菌も、この点ではまったく同じである。ある意味で私たち人間も細菌も太古の時代に光合成という技術革新をすることができなかった負け組と言える。負け組なので、植物を破壊することによってエネルギーを横取りしようとしている、やや残念な生物群と言える。

従属栄養は有機物を破壊する

解糖系とは何か、クエン酸回路とは何か、わかりやすく説明すると

 上に説明したように、そもそも呼吸とは植物が光合成によって合成した有機物を従属栄養微生物が破壊する行為である。つまり、呼吸とは、生物がエネルギー源となるブドウ糖を分解して、そこに含まれる化学エネルギーを取り出す過程である。


 この際、酸素なしでのエネルギー獲得系を 解糖系(もしくは、発酵) という。 解糖系 のみでも生きていけるのは通性嫌気菌である。酸素なしの解糖系の代謝では、炭素6個の糖を、炭素2個や3個で構成される有機酸やアルコールなどに分解する。しかしこのシステムでは、二酸化炭素(炭素1個)にまで分解することはできない。解糖系では、後述するクエン酸回路を用いる場合と比べると少ないエネルギーしか獲得できない(2ATP)。つまり、通性嫌気菌は、有機物を中度半端に分解するだけでも多少のエネルギーを得ることができるが、大量のエネルギーを得ることができない。

 一方、酸素等(酸素以外を使用する場合もある、後述)を使って、炭素6個のブドウ糖を炭素1個の二酸化炭素(すなわち無機物)にまで徹底的に分解して、大量のエネルギーを取り出す行為を、呼吸という。炭素1個の二酸化炭素にまで分解するためには、酸素を必要とするクエン酸回路と呼ばれる複雑な代謝経路が必要である。この場合、発酵に比べると10倍以上のエネルギーを獲得できる(38ATP)。

   解糖系 やクエン酸経路による有機物のの破壊の仕方について、もう少し詳しく見ていきたい。少し幼稚なたとえ話になるが、 解糖系(発酵) や好気呼吸から生じてくるエネルギーの量について理解するのにわかりやすいと思うので、次のようなたとえ話で説明をしていきたい。

 今ここにいる6人の子どもたちがディズニーランドに遊びに来たと想定しよう。この6人の子供達に3人ずつのグループ、あるいは2人ずつのグループに分かれるようにお願いした場合に、比較的簡単に6人は3人や2人に分かれる。つまり、この子供たちをつなぎ合わせているエネルギーはそれほど高くない。この6人を炭素として考えれば6人はグルコースであり、3人は乳酸、2人は酢酸となる。つまりグルコースから乳酸や酢酸にするのは簡単ということである。しかし、この程度の分解から発せられるエネルギーは小さい。

解糖系に関する例え話

 一方、今度は2人の子供達に1人1人別れてディズニーランドで遊んでね、とお願いしたらどうだろう?子供達は猛烈な抵抗をする。一人では迷子になってしまうかもしれないし、そもそも一人で遊んでもつまらない。つまり2人組をつなぎ合わせているエネルギーは猛烈に高い。これを炭素に戻して考えると炭素が2つのもの(酢酸)を1つ(二酸化炭素)にするのは極めて困難だということだ。

酢酸を二酸化炭素に分解するのは難しい

 そこで2人の子供達に、クエン酸回路というジェットコースターに乗ってごらん、と誘う。クエン酸回路で走ってくる乗り物の部分、すなわちコースターの部分は、オキサロ酢酸(炭素が4個)である。子供達はすんなりとこのコースターに乗り、クエン酸回路コースターを一周する。とても楽しいので、2人を結びつけていたエネルギーが発散される。

クエン酸回路をわかりやすくジェットコースターに例えると
クエン酸回路ジェットコースターでエネルギーが発散される

 そして、クエン酸コースターから降りた時にはすでにエネルギーが抜き取られており、2人を1人ずつに分けることが簡単となっている。これがクエン酸回路もしくはクレブス回路もしくは TCA 回路ということになる。

 以上、ジェットコースターの例えで発酵とクレブス回路の説明をした。 炭素が六個のグルコースから炭素3個や2個の有機酸までに分解するのが比較的簡単である。しかし、この程度の分解では、そこから生じるエネルギーが少ない。一方、炭素が2個の酢酸から炭素が1個の二酸化炭素に分解するのは極めて困難である。しかし、それらを分解すれば大量のエネルギーが出てくる。まずは、これらのことをわかりやすく理解しておけばよい。

酢酸から二酸化炭素へ分解される過程をわかりやすく子供たちに例えると

真空包装と通性嫌気菌の増殖

 以上のような理解は、実際の真空包装食品中での通性嫌気菌の増殖を考える場合に役に立つ。例えば大腸菌を、標準寒天培地の上に接種したとしよう。2つのシャーレの一方はそのまま空気中で培養し、もう一方は、シャーレ全体を真空包装してみる。培養後に大腸菌の増殖を観察する。

 ここで単純に教科書的に、 「通性嫌気菌は酸素があってもなくても増殖できる」とだけ、文字通り理解しているだけでは、どちらのシャーレでも同じ程度の増殖ができると勘違いする可能性がある。学生に質問してみると、実際にそのように回答する学生も多い。しかし実際は、空気中で培養した場合の方が嫌気培養をした場合よりも大腸菌は大きなコロニーを形成する。上記のように解糖系とクエン酸回路で得られるエネルギーの違いを理解しておけば、このことは理解できる。

 このような理解も実際の食品中での真空包装での通性嫌気性菌の増殖を考える場合での見落としがちな点である。

真空包装と通性嫌気菌の増殖

電子伝達系とは何か、好気呼吸と嫌気呼吸、わかりやすく説明すると


以上のように解糖系とは何か、クエン酸回路とは何かについて理解したうえで、次に、電子伝達系とは何か、好気呼吸(酸素呼吸)と嫌気呼吸について説明をする。

 電子伝達系(水素伝達系、呼吸鎖)は、クエン酸回路において酢酸(炭素2個)が二酸化炭素(炭素1個)にまで分解される際に放出されるエネルギーである水素を、最終的にATP(生物体内でのエネルギーの貨幣)に変換する 装置である。

 この際、この水素(もしくは電子と考えても良い)を最終的に受け取ってくれる物質が必要となる。すなわち、酸素呼吸の場合は、この役割を果たすのが酸素である。

2H + 1/2 O  → H

注)なお、クエン酸回路からの放出された水素を運搬するのがNADと呼ばれる水素運搬体であるが、ここではエネルギーの理解の本質から逸れるので詳細な説明は省略した。

解糖系とクエン酸回路

 一方、偏性嫌気性菌(一般に嫌気菌と呼称される)は酸素を利用できず、嫌気呼吸により増殖する。嫌気性菌の代謝経路は、好気性細菌と本質的に同じ生化学経路(発酵、クエン酸回路)を持っている。但し、これらの細菌は、電子伝達系の最終電子受容体として酸素の代わりに硝酸や硫酸などを用いる。

 私たちは呼吸といえば酸素呼吸と考えがちである。しかし、実は微生物の世界では酸素だけがクエン酸回路の水素の最終受容体ではない。酸素に限定せずに、たとえば、硫酸イオンや硝酸イオンを使うことができる。酸素が最終的な水素の受容体の場合は最終産物は上述したように水である。一方、硫酸イオンが最終的な水素の事業体の場合は最終産物は硫化水素となる。

SO4 2- +8e- + 10H+ →H2S+4H2

最終水素受容体としての硫酸イオン

 実は呼吸の歴史においては酸素を水素受容体とするよりも硫酸イオンを水素受容体とする進化の方がはるかに先輩となる。なぜならば、仮に、生命の歴史を1年に例えて、地球上に原子細菌が誕生したのは1月1日とすれば、光合成細菌が誕生して地球上に酸素が充満し始めなのが4月上旬以降である。それまでは地球上には酸素は存在していなかった。すなわち、クエン酸回路において酸素を受容体とする形式は、地球上に酸素が充満したためにそれを積極的に利用しようとして出てきた後発的な代謝と言える。

生態系での物質循環と微生物

 以上の微生物の発酵代謝や呼吸を自然界での役割との関係でみておこう。

 今、魚が池の表面で死んだと想定しよう。初めは魚の表面に シュードモナスなどの好気性細菌が勢いよく増殖する。 シュードモナス は地球生態系における分解者だ。 シュードモナス は酸素がある状況下では他の細菌より速く増殖することができる。しかし酸素がない状況下では増殖できない。池の中に浮かんだ腐った魚はシュードモナスにより部分的に分解されます。しかし、この過程で腐った魚の中に酸素がなくなる。

自然界における好気性細菌

 そこでつぎに通性嫌気性細菌が働き始める。通性嫌気性細菌は酸素がある時には クエン酸回路を用いて活発に増殖する。一方、酸素がない状況下でも、発酵代謝経路を用いて増殖できる。 しかしこのような発酵代謝の大きな欠点は、有機物を完全に二酸化炭素と水に分解することができないということだ。上述したように、酸素なしの解糖系の代謝(発酵代謝)では、炭素6個の糖を炭素2個や3個で構成される有機酸やアルコールなどに分解することができる。しかしこのシステムでは、有機酸やアルコールを二酸化炭素にまで分解することはできない。

自然界における通性嫌気菌

 自然界の分解過程において、通性嫌気菌だけしか存在していないとすると、どうなるか?有機酸がそれ以上分解されずに地球上に蓄積することになる。つまり、自然界で魚や鳥や野菜が腐敗するとヨーグルトやチーズのような発酵食品の段階で、そのまま放置されることになる。地球全体がひとつの発酵食品と化してしまうことになる。

 自然生態系で、有機酸が二酸化炭素や水のような無機物に分解されるためは、次に述べる偏性嫌気性細菌の存在が不可欠なのた。

地球がヨーグルトに変身

 偏性嫌気性細菌は酸素がない環境下でも有機酸やアルコールなどを二酸化炭素と水にまで完全に分解することができる。すでに述べたように、偏性嫌気性細菌は好気性細菌と同じく クエン酸回路を持っている。ただ好気性細菌と異なる点は、 クエン酸 回路から出てくるエネルギーのもとである水素の受容体として、酸素ではなく、硫酸イオン、もしくは硝酸イオンなどを用いることができる点である。つまり偏性嫌気性細菌は、酸素がなくても、好気性細菌と同じように効率的に有機物を二酸化炭素にまで分解できる。そしてその過程でかれらは大量のエネルギーを得ることができる。
 食品微生物学の観点からは、偏性嫌気性細菌の代表としてボツリヌス菌を学ぶ。ボツリヌス菌は真空包装食品において最大の危害菌であるため、偏性嫌気菌を、私たちは悪者扱いしがちである。しかし、地球生態系の元素循環が成立するためには偏性嫌気菌の存在が不可欠なのである。汚れた下水溝の底泥から、嫌気呼吸の最終産物である硫化水素ガスをぶくぶく出しながら、これらの嫌気菌が嫌気呼吸を行い、通性嫌気菌による発酵により生じた有機酸などを最終的に無機化しているのである。

自然界における偏性嫌気菌

このように、偏性嫌気菌は地球生態系における元素の循環の観点からは、はなくてはならない存在である。このような地球生態学の観点から微生物を見ておくことも必要である。

OF試験の原理ー好気性細菌と通性嫌気性菌を見分ける方法として

  以下に、寒天培地に出現したコロニーが好気性細菌なのか通性嫌気性細菌なのを区別する簡単な方法を述べる。OFテストと呼ばれるものである。

好気性細菌と通性嫌気菌の見分け方

 このテストはとても簡単に実施できる。2本の試験管のチューブの中に寒天培地を入れておく。そしてその寒天培地の中にはペプトンなどの栄養素とともにグルコースが入っている。

OF試験

 さらにはこの寒天培地の pH を色で判定するために pH 指示薬を入れておく。ここで用いる pH 指示薬  であるbromthymol blue は pH 中性であれば緑色であるが、 pH が酸性になると黄色くなる。そして2本の試験官 に調べたい細菌の培養を接種する。接種の後、一本の試験官の培地の表面に流動パラフィンのような油をかぶせる。このようにすることによって培地表面への酸素の供給を遮断する。つまり2本の寒天培地のうち一本は酸素が十分供給されるシステムとし、もう一本は酸素が十分に供給されないシステムとする。

OF試験の結果判定

 このテストは厳密に言えば、微生物がブドウ糖を発酵する能力を判定するテストである。しかし両培地での細菌の増殖を観察することによって細菌が好気性細菌なのか通性嫌気性なのかについて判断することも可能である。酸素が供給されている試験管にのみ増殖が認められるならば、その細菌は好気性細菌と判定できる。流動パラフィンをかぶせた培地の中においてもまた微生物の増殖が認められれば、その細菌は通性嫌気性菌と判定することがでできる。

 また、この試験は微生物がブドウ糖を発酵する能力をもっているかを判定するテスト ではあるが、好気性細菌の場合は、流動パラフィンのない試験管のみが黄色に変色し、通性嫌気菌の場合は両方の試験官が黄色に変色する。微生物が増殖することによって培地中に含まれているブドウ糖が分解され結果として酸が 生じるからである。

注)まれに、グルコースを利用できない細菌が存在する。その場合は、試験管で増殖のみが観察され、培地は黄色に変化しない。この場合も、両試験管での菌の増殖を目視観察し、好気性細菌か通性嫌気菌かを判別すればよい。

判定結果の解釈

 以上のようにOF試験で判定し、分離株がグラム陰性菌で好気性細菌ならば、シュードモナス のような腐敗細菌と想定すればよい。このグループは、食品を腐らせる可能性はあるが、感染型食中毒の原因にはなれない。なぜか?なぜならば人間の腸の中には酸素が不足しているからである。好気性細菌のように酸素を要求する細菌がヒトの腸の中で活発に増殖して腸内細菌との競合に打ち勝つことは難しい。一方で彼らは、酸素が存在するととても早いスピードで増殖します。 従って彼らは動植物の腐敗初期段階で大きな役割を演じる。

好気性細菌は感染型食中毒にならない

 グラム陰性菌で通性嫌気菌の判定になれば、サルモネラ腸管出血性大腸菌などのほとんど全ての感染型食中毒の原因菌を含むので、要注意である。通性嫌気菌の場合は、食品の流通環境のような酸素が豊富な環境においてもクエン酸回路で活発に増殖をし、一方で人の腸内の中のように酸素がない環境でも増殖できるという特性を持つ。 この特性こそが食品を媒介した感染型食中毒を起こしやすい理由である。

 以上のように、グラム陰性菌は、はじめに好気性細菌と通性嫌気菌に分けることが重要である。